Bakteri Shigella sonnei (golongan Shigella sp) merupakan bakteri patogen penyebab penyakit disentri basiler (shigellosis). Penyakit infeksi saluran pencernaan umumnya diobati antibiotik, tetapi seiring berjalannya waktu resistensi terhadap antibiotik sintesis ditemukan. Hal ini membuat pencarian bahan alam dengan efek antibakteri sebagai alternatif mulai dikembangkan. Salah satu bahan alam yang memiliki senyawa metabolit sekunder dengan efek antibakteri adalah daun kitolod (Isotoma longiflora (Wild.) Presl.). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antibakteri fraksi n-heksan, fraksi kloroform, dan fraksi etanol ekstrak daun kitolod terhadap bakteri Shigella sonnei. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 96%, dan selanjutnya dilakukan fraksinasi dengan metode ekstraksi cair-cair menggunakan pelarut etanol, kloroform, dan n-heksan dengan konsentrasi 10% v/v, 20% v/v, 30% v/v, dan 40% v/v. Pengujian daya hambat dilakukan dengan metode difusi sumuran pada media MHA, serta diukur zona hambat yang terbentuk. Skrining senyawa metabolit sekunder dilakukan dengan metode KLT . Hasil penelitian diketahui bahwa seluruh fraksi dari ekstrak daun kitolod memiliki potensi dalam menghambat pertumbuhan bakteri Shigella sonnei, sedangkan fraksi teraktif didapatkan dari fraksi etanol konsentrasi 40% v/v dengan zona hambat tertinggi sebesar 20,50 mm. Uji skrining menyatakan ekstrak daun kitolod mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, saponin, dan steroid.