Indonesia menjadi negara dengan populasi pemeluk Agama Islam mayoritas. Dengan banyaknya jumlah Muslim maka makanan yang akan diprioritaskan adalah makanan halal, karena umat Muslim memiliki aturan dalam hal konsumsi makanan. Bakteri Escherichia coli menjadi penyebab keracunan yang sering terjadi di banyak tempat penyelenggaraan makanan massal. Infeksi pada manusia yang disebabkan oleh bakteri E.coli dapat berasal dari sumber air yang dipakai untuk pengolahan makanan ataupun pada lingkungan dapur yang tidak bersih. Penelitian ini menganalisis hubungan pengetahuan kehalalan pangan dengan perilaku penjamah makanan dan keberadaan bakteri E.coli. Penelitian ini menggunakan studi cross sectional. Pengecekan mikroba di laboratorium menggunakan metode MPN. Sampel menggunakan metode total sampling dengan jumlah 38 sampel, E.coli diambil dari sumber air, makanan dan minuman pada 3 dapur. Penilaian pengetahuan kehalalan pangan dengan perilaku penjamah makanan menggunakan kuesioner. Uji statistik yang digunakan yaitu uji spearman. Tidak terdapat hubungan antara pengetahuan kehalalan pangan dengan perilaku kehalalan pangan dengan p 0,71, pengetahuan kehalalan pangan dengan keberadaan E.coli p 0,158. Tidak terdapat hubungan antara pengetahuan kehalalan pangan dengan perilaku kehalalan pangan pada penjamah makan dan pada keberadaan bakteri E.coli.