Selulase adalah enzim kompleks yang memotong secara bertahap rantai selulosa menjadi glukosa. Enzim selulase banyak dihasilkan dari berbagai jenis mikroba baik bakteri atau kapang indigenous dari biomassa limbah pertanian, salah satunya berasal dari biomassa limbah minyak kayu putih. Salah satu pemanfaatan enzim selulase adalah diguanakan pada proses biokonversi biomassa lignoselulosa pertanian menjadi bioetanol. Penelitian ini Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi mikroba selulolitik dari biomassa limbah industri minyak kayu putih.Hal ini merupakan dasar pada pemanfaatan selulase tersebut dapat dimanfaatkan untuk degradasi biomassa limbah minyak kayu putih menjadi bietanol. Berdasarkan hasil analisa komponen selulosa limbah minyak kayu putih didapatkan kandungan selulosa sebesar 32,37%. Hasil isolasi mikroba asal biomassa minyak kayu putih didapatkan sembilan isolat potenisn selulolitik dengan nilai indek selulolitik terbesar pada isolat C9. Isolat C9 memiliki waktu optimum produksi enzim pada jam ke-16 masa pertumbuhan dari mikroba tersebut. Hasil hidrolisis enzimatik selama satu jam, biomassa minyak kayu putih dengan menggunakan enzim selulase menghasilkan derajat polimerasi sebesar 2,6. Kata kunci : limbah minyak kayu putih, biomasa, bioetanol